多肽和蛋白的相互作用
檢測(cè)與某一多肽相互作用的物質(zhì)，最簡(jiǎn)單的方法就是利用此多肽做親和pull-down實(shí)驗(yàn)，然后直接檢測(cè)結(jié)合蛋白。蛋白質(zhì)體外結(jié)合(Pull-down)試驗(yàn)可用于驗(yàn)證蛋白-蛋白相互作用的存在（經(jīng)由別的研究方法預(yù)測(cè)過(guò)的，如免疫共沉淀）和作為一種初級(jí)的篩選試驗(yàn)來(lái)識(shí)別一些未知的蛋白-蛋白相互作用。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性阻斷結(jié)合，合成肽通常被用來(lái)驗(yàn)證被假設(shè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
生物素標(biāo)記肽含有一個(gè)特殊的功能區(qū)和相當(dāng)于參照的未修飾肽，此肽可被錨定在親和素共軛的磁珠上，將這些磁珠與目標(biāo)樣本共同孵育（如核提取物或純化的重組蛋白），通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的蛋白，然后洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)， SDS/ PAGE分析，經(jīng)蛋白染色即可直接觀察。通過(guò)比較分別與修飾和未修飾多肽相結(jié)合的蛋白質(zhì)，即有可能確定候選者，即特定功能蛋白的“reader”蛋白。
帶有一些特殊修飾的生物素標(biāo)記肽可以通過(guò)化學(xué)合成，純度達(dá)80％以上。肽長(zhǎng)度應(yīng)該在15-20個(gè)氨基酸。目標(biāo)修飾位于序列中間時(shí)，兩翼氨基酸殘基不能少于6-8個(gè)。一般情況下，生物素多被偶聯(lián)在N末端或C末端。如果無(wú)特殊要求，我們建議生物素偶聯(lián)至N-末端，其優(yōu)勢(shì)是修飾的成功率更高，生產(chǎn)的時(shí)間更短，并且易于操作。此外，如果偶聯(lián)至C-末端，需要額外增加一個(gè)賴(lài)氨酸。
生物素標(biāo)記肽的Pull-down實(shí)驗(yàn)方案
生物素標(biāo)記肽可與親和素磁珠共軛以生成樹(shù)脂，用于肽pulldown試驗(yàn)。先把生物素標(biāo)記肽上樣至Immobilized streptavidin beads (Pierce) 錨定有親和素的磁珠上，再與細(xì)胞裂解液孵育。細(xì)胞裂解于1％（v/v）Nonidet P-40, 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, protease inhibitors (Complete Tablets, Roche Applied Science),
加入 1 mM sodium orthovanadate作為磷酸酶抑制劑。等量的蛋白質(zhì)分別與被錨定的多肽在4℃孵育6小時(shí)。經(jīng)過(guò)大量洗滌，在SDS樣品buffer中煮沸，結(jié)合蛋白可從被錨定的多肽洗脫下來(lái)，或者，用50 mM dithiothreitol將多肽與蛋白復(fù)合物從磁珠中斷開(kāi)。將來(lái)自活性肽和對(duì)照目標(biāo)肽pull-downs的洗脫液合并，以作進(jìn)一步的分析。
上圖為鏈霉親和素-生物素鍵力測(cè)量示意圖。由于它們異常高的親和結(jié)合性，其中最突出的配體-受體對(duì)是鏈霉親和素-生物素（streptavidin-biotin）和親和素-生物素（avidin-biotin）。 這兩種蛋白質(zhì)都有一個(gè)四聚體的結(jié)構(gòu)，這樣他們可以結(jié)合4個(gè)配體。
|
