穿透細胞膜進入細胞內(nèi)是許多作用靶點在細胞內(nèi)的生物大分子發(fā)揮作用的先決條件，然而生物膜的生物屏障作用阻止了許多高分子物質(zhì)進入細胞內(nèi)，從而很大程度地限制了這些物質(zhì)在治療領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，如何引導(dǎo)這些物質(zhì)穿透細胞膜是一個迫切需要解決的問題，目前介導(dǎo)生物大分子穿透細胞膜的方法主要包括細胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）、脂質(zhì)體、腺病毒、納米顆粒、影細胞等，而CPPs是一類以非受體依賴方式，非經(jīng)典內(nèi)吞方式直接穿過細胞膜進入細胞的多肽，它們的長度一般不超過30個氨基酸且富含堿性氨基酸，氨基酸序列通常帶正電荷。

1型人免疫缺陷病毒轉(zhuǎn)錄激活因子TAT（human immunodeficiency virus-1 transcription activator， HIV-1 TAT）是第一個被發(fā)現(xiàn)的細胞穿透肽，它憑借一種無毒的、高效的方式進入細胞。

細胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）的一個重要特點是可以攜帶多種不同大小和性質(zhì)的生物活性物質(zhì)進入細胞，包括小分子化合物、染料、多肽、多肽核酸（peptide nucleo acid, PNA）、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒DNA、siRNA、200nm的脂質(zhì)體、噬菌體顆粒和超順磁性粒子等，這一性質(zhì)為其成為靶向藥物的良好載體提供了可能。CPPs作為載體的優(yōu)勢在于低毒性和無細胞類型的限制，盡管CPPs可輸送不同類型的物質(zhì)進入細胞，但其實際應(yīng)用多集中于寡肽、蛋白質(zhì)、寡聚核苷（oligonucleotides，ONs)或類似物的細胞轉(zhuǎn)運。

• CPP–oligonucleotides
• 跨膜機制
• CPPs序列
• HIV-1 TAT

CPPs 多肽合成修飾: CPP作為有效的基因轉(zhuǎn)運載體，其與寡聚核苷的連接是以非共價形式連接。而非共價連接方法比較簡單，僅有賴于CPP和外源物質(zhì)按一定比例混合。非共價復(fù)合物通過胞漿膜后，在細胞內(nèi)部解離，釋放物質(zhì)到達細胞靶位。 簡單的混合方法: Example: For MPG mediated gene delivery, peptide carrier/DNA complexes were formed in DMEM or phosphate-buffered saline (500 ml of DMEM containing 100 ng of DNA complexed with MPG at a charge ratio of 5:1) and incubated for 30 min at 37°C. Cells grown to 60% confluence were then overlaid with these preformed complexes. CPPs與寡聚核苷形成的納米復(fù)合物在血清蛋白存在的環(huán)境下也不會分離，與目前市售的陽離子型的脂質(zhì)體相比，CPPs有更高的細胞轉(zhuǎn)染效率。 許多新型的CPPs被證實憑借一種無毒的方式轉(zhuǎn)染各種類型細胞，并在胞內(nèi)產(chǎn)生明顯的生物學(xué)反應(yīng)。體內(nèi)實驗表明，CPPs介導(dǎo)的寡聚核苷可有效地抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，而且不會激發(fā)體內(nèi)的免疫反應(yīng)，彰顯了CPP-ON復(fù)合物在基因治療領(lǐng)域的希望和巨大潛力。其優(yōu)勢在于入胞速度快，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，生理狀態(tài)下穩(wěn)定、無毒、無免疫性等。 表1: CPP介導(dǎo)siRNA（非共價連接）的應(yīng)用與效果 CPP 細胞類型 效果 參考文獻 MPG ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cys The cysteamide stabilises the carrier/DNA particle, as similarly reported for gene delivery mediated by cysteine-containing peptides. HeLa,Cos-7 HS68, NIH-3T3 Cellular uptake of single- and double-stranded ONs 50 nmol/l siRNA→85% and 78% luciferase downregulation Simeoni et al.   HS68 100 nmol/l siRNA→60% GAPDH downregulation Simeoni et al. MPGΔNLS ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cys HeLa, Cos-7 50 nmol/l siRNA→95% and 90% luciferase downregulation Simeoni et al.         Stearyl-R8 st-RRRRRRRR-NH2 Polyarginine peptides, which are very efficient CPPs have been used for siRNA delivery into cells. Stearylated octaarginine (Stearyl-R8), are able to encapsulate and shuttle nucleic acids through cell membranes without the need to covalently attach the nucleic acid to the arginine-containing carrier peptide. EGFP-expressing hippocampal neurons 16 nmol/l siRNA→>50% reduction in EGFP activity T?nges et al.         EB1 LIKLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-amide HeLa, HepG2 Luciferase downregulation Lundberg et al.         Tat-DRBD GRKKRRQRRRPQ-DRBD H1299, HUVEC, Jurkat T, hESC >90% reduction in GAPDH mRNA level Eguchi et al.         PF6 St-AGYLLGK[kk2sa4qn4]INLKALAALAKKIL-NH2 Hepatoma, MEF, HUVEC, mESC Significant downregulation of HPRT1 El-Andaloussi et al.

不同的細胞穿透肽（CPP）跨膜機制不同，一個細胞穿透肽（CPP）的具體機制有賴于幾個參數(shù)，如分子大小（攜帶物質(zhì)）、溫度、細胞類型和細胞內(nèi)外的穩(wěn)定性等。細胞穿透肽（CPP）進入細胞的具體機制目前還不清楚，比較流行的推測包括以下三種： A: 倒置膠粒模型（inverted micelle model），CPPs通過細胞膜上磷脂分子的移動形成倒置膠粒結(jié)構(gòu)，而進入胞漿。 B: 直接穿透，即孔隙結(jié)構(gòu)模型 (pore formation model)，CPPs在細胞膜上組成跨膜的孔隙結(jié)構(gòu)而進入胞漿 。 C: 內(nèi)吞方式進行細胞攝取。 來源: Cell-penetrating peptides and their therapeutic applications, Victoria Sebbage, BioscienceHorizons, Volume 2, Number 1, March 2009.

自從細胞穿透肽Tat的發(fā)現(xiàn)，細胞穿透肽的數(shù)量也在不斷地增加。以下表格列舉了部份已知的細胞穿透肽（CPPs），以及它們的來源和詳細的序列信息。 名稱 來源 序列 Tat (48-60) HIV-1 protein GRKKRRQRRRPPQQ Oligoarginine Tat derivative Rn plsl Igl-1 homeodomain RVIRVWFQNKRCKDKK Transportan Galanin-mastoparan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL P-alpha gp41-SV40 GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRRV      Stearyl-R8 Stearly-RRRRRRRR-amide (Stearyl = CH3(CH2)16CO-)

細胞穿透肽 HIV TAT 細胞穿透肽（如HIV TAT）可以以直接穿透和內(nèi)吞兩種方式進入細胞。HIV TAT或者簡單的多聚精氨酸可被設(shè)計作為有效的藥物載體，但CPP（如HIV TAT）是如何實現(xiàn)胞膜轉(zhuǎn)運，目前仍不清楚。 簡單的HIV TAT是如何促進象直接穿透和內(nèi)吞作用的入胞機制的呢？來自Gerard Wong實驗室的研究人員研究了在不同的條件下，HIV TAT是如何與細胞質(zhì)膜、細胞骨架、特異的胞膜受體相互作用，從而誘導(dǎo)了多重轉(zhuǎn)運途徑。查看來自Gerard Wong實驗室的論文：http://bit.ly/zQrH6t. 有趣的是，TAT在不同條件下可與同一序列發(fā)生多種不同的反應(yīng)，因而與胞膜、細胞骨架、特異受體相互作用可產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)運途徑。 CPP的跨膜機制與多肽序列存在很敏感的關(guān)系，如果在一個純親水性的CPP中增加一個疏水殘基，就能徹底地改變其轉(zhuǎn)運機制，例如，最簡單的CPP原型-多聚精氨基（polyR），可以誘導(dǎo)細胞膜上形成跨膜的孔隙結(jié)構(gòu)。疏水氨基酸通過插入胞膜來形成正曲率，精氨酸可同時形成正曲率和負曲率，賴氨酸只能沿一個方向形成負曲率，這就意味著在精氨酸與賴氨酸/疏水物之間存在補償關(guān)系。 如果疏水性有助于形成負高斯曲率（Gaussian curvature），那為什么TAT肽中的疏水含量相對較低呢？其原因是CPPs都是利用盡可能少的疏水基去形成saddle-splay curvature。序列上的差異很可能只會在膜上誘導(dǎo)短暫的類似孔隙的跨膜結(jié)構(gòu)，從而形成對CPP來說更短的孔隙壽命。由于CPP的氨基酸組成不同，TAT肽在有或無受體情況下都可以介導(dǎo)細胞內(nèi)吞作用。

參考文獻:

Simeoni, F, Morris, MC, Heitz, F and Divita, G (2003). Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res 31: 2717–2724.

T?nges, L, Lingor, P, Egle, R, Dietz, GP, Fahr, A and B?hr, M (2006). Stearylated octaarginine and artificial virus-like particles for transfection of siRNA into primary rat neurons. RNA 12: 1431–1438.

Morris, MC, Vidal, P, Chaloin, L, Heitz, F and Divita, G (1997). A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res 25: 2730–2736.

Andaloussi, SE, Lehto, T, M?ger, I, Rosenthal-Aizman, K, Oprea, II, Simonson, OE et al. (2011). Design of a peptide-based vector, PepFect6, for efficient delivery of siRNA in cell culture and systemically in vivo. Nucleic Acids Res 39: 3972–3987.

Eguchi, A, Meade, BR, Chang, YC, Fredrickson, CT, Willert, K, Puri, N et al. (2009). Efficient siRNA delivery into primary cells by a peptide transduction domain-dsRNA binding domain fusion protein. Nat Biotechnol 27: 567–571.

Lundberg, P, El-Andaloussi, S, Sütlü, T, Johansson, H and Langel, ? (2007). Delivery of short interfering RNA using endosomolytic cell-penetrating peptides. FASEB J 21: 2664–2671.

細胞穿透肽的合成報價

• 方法一： 通過在線的報價系統(tǒng)

                       

• 方法二：下載并填寫 多肽合成訂單表，請將填寫好的表格E-mail至peptide@lifetein.com，我們的工作人員將在24h內(nèi)給您詳細報價。