多肽合成：合成多肽的處理與保存

1. 我該如何處理和保存多肽？
2. 如何溶解多肽？
3. 是否可以預(yù)測一個肽段是可溶的？
4. 如何選擇適合自己研究的多肽純度？
5. 什么是多肽的純度？
6. 什么是肽凈含量？
7. 應(yīng)該如何選擇多肽的鹽形式？
8. 如何合成多肽？
9. 澤溪源如何對我的多肽進行質(zhì)檢？
10. 公司對合成的多肽提供分裝服務(wù)嗎？
11. 什么是原料藥（APIs）、目錄肽（catalog peptides）、合成肽（custom peptide synthesis）？
12. 單個訂單的最少合成量是多少？
13. 澤溪源能夠合成的多肽的最大長度是多少？
14. 什么是固相合成？
15. 什么是樹脂和鏈接劑
16. 什么是保護基團？
17. 什么是N端乙酰化、C端酰胺化修飾？
18. 熒光標(biāo)記時，肽和修飾標(biāo)記的染料之間是否需要添加一個間隔？
19. 怎樣計算多肽的濃度?
20. 如何利用SDS-PAGE法去除小的多肽？
21. 如何將多肽溶解在DMSO中？

1. 我該如何處理和保存多肽？

凍干粉形式的多肽，經(jīng)密封包裝可在常溫條件下穩(wěn)定運輸，溶解狀態(tài)的多肽不宜長期保存。

多肽保存指南：需要長期保存的多肽，應(yīng)以凍干粉形式存放在含有干燥劑的密封容器內(nèi)，置于-20°C保存，-80°C效果更好，可以最大限度地避免多肽降解。這種儲存方式可以使多肽可保存數(shù)年，避免了被細菌降解和氧化，也可以避免二級結(jié)構(gòu)的形成。

打開包裝： 在打開包裝和稱重前，請先將多肽在干燥器中平衡至室溫。因多肽往往具有吸濕性，未經(jīng)平衡到室溫的多肽在打開蓋子后易凝結(jié)，從而降低了多肽產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

稱重： 迅速稱取您所需的多肽，并將剩余多肽繼續(xù)儲存在-20°C或更低溫度。與其他多肽相比，含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短。

2. 如何溶解多肽？

多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性。酸性的蛋白溶解于堿性溶液，而堿性蛋白可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有機溶劑中，如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或異丙醇，然后加水（蒸餾水）稀釋。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因為DMSO可能造成側(cè)鏈氧化。

多肽溶解測試： 在多肽溶解之前先取小部分進行多肽溶解測試，您需要測試幾種不同的溶劑，直到找到最適當(dāng)?shù)囊环N。超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度。（注意: 超聲處理會引起溶液發(fā)熱和多肽降解。）

1. 將每個酸性氨基酸賦值為－1，包括天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、以及羧基末端-COOH。每個堿性氨基酸賦值為＋1，包括精氨酸（R）、賴氨酸（K）、組氨酸（H）以及氨基末端-NH2。然后計算整個多肽的電荷數(shù)。
2. 如果整段肽所帶電荷是陽性的，說明該肽是堿性的?？上葒L試用蒸餾水來溶解；如果不溶于水，接著嘗試用少量10%-25%醋酸溶解，如果仍然失敗的話，添加一些TFA（10-50微升）來增溶，然后用水稀釋至理想濃度。
3. 如果整段肽所帶電荷是陰性的，說明該肽是酸性的。酸性的多肽可以嘗試用PBS（PH 7.4）來溶解，如果不溶的話，添加少量的堿性溶劑，如0.1 M的碳酸氫銨，然后加水稀釋至理想濃度。含有游離半胱氨酸的多肽應(yīng)溶于脫氣的酸性緩沖液中，因為當(dāng)PH值大于7時，巰基會被迅速氧化成二硫化物。
4. 如果整段肽電荷是零，說明肽是中性的。中性肽通常溶于有機溶劑。首先，嘗試添加少量乙腈、甲醇或異丙醇。對于高度疏水的多肽，可使用少量的二甲基亞砜溶解，然后用水稀釋至理想濃度。對于含有自由半胱氨酸的肽，需使用DMF而不是DMSO。對于有聚集傾向的肽，可添加6M鹽酸胍或8M尿素，然后進行必要的稀釋。

為了防止或盡量減少多肽降解，請將多肽以凍干粉形式保存在-20°C，-80°C更佳。如果需要保存溶液肽，最好分成小樣存放，以避免反復(fù)凍融。一份樣品融凍后未用完，應(yīng)扔掉。細菌降解有時會成為溶液肽的麻煩，所以請將肽溶于無菌水或肽溶液過濾除菌。

堿性氨基酸: K, R, H, N-terminus
酸性氨基酸: D, E, C-terminus
極性中性氨基酸: F, I, L, M, V, W, Y
非極性疏水氨基酸: G, A, S, T, C, N, Q, P, 乙?；?，酰胺基

舉例說明：
RKDEFILGASRHD: (+5) + (-4) = +1 認(rèn)為是堿性多肽，見步驟2
EKDEFILGASEHR: (+4) + (-5) = -1 認(rèn)為是酸性多肽，見步驟3
AKDEFILGASEHR: (+4) + (-4) = 0 認(rèn)為是中性多肽，見步驟4

3.一個肽段是否可溶能預(yù)測嗎？

我們無法通過研究多肽的結(jié)構(gòu)來預(yù)測其在水中的溶解度。然而，賴氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍通常有助于預(yù)測溶解度，尤其是短肽。與此相反，含有天門冬氨酸和谷氨酸的酸性肽往往是不易溶于水的，但易溶于稀氨水或堿性緩沖液。

4. 如何選擇適合自己研究的多肽純度？

粗品肽不推薦用于生物實驗。粗肽可能含有大量的非肽類雜質(zhì)，如殘留的有機溶劑、清除劑、TFA和其他不完整肽。TFA不能被完全消除，通常交付的肽以TFA鹽的形式存在。如果殘留的TFA影響您的實驗，我們推薦其他鹽形式，如醋酸鹽和鹽酸鹽等。這些鹽通常比常規(guī)TFA鹽貴20-30%以上。這是由于在轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)更多的肽損失和需要更多的原材料。

LifeTein建議對各種項目采用以下級別的肽純度：

>70% 肽純度

• 肽微陣列
• 作為制備抗體的抗原
• 層析法
• 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測抗血清滴度

>80% 肽純度

• 免疫印跡法（非定量）
• 酶底物肽（非定量）
• 封閉肽（非定量）
• 親和純化
• 磷酸化檢測
• 蛋白電泳的應(yīng)用和免疫細胞化學(xué)

>95% 肽純度

• 標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附試驗和RIA（定量）
• 受體配體相互作用（定量）
• 體內(nèi)、體外 生物學(xué)測定
• 酶的研究和阻斷實驗（定量）
• NMR研究
• 質(zhì)譜分析
• 其他定量檢測

>98% 肽純度

• SAR研究
• 臨床試驗
• APIs(藥物活性成分)
• 工業(yè)品
• X-ray晶體研究
• 其他敏感的實驗：酶與底物、受體與配體相互作用、阻斷和競爭實驗

5. 什么是多肽的純度？

多肽的純度是指HPLC方法在214nm處檢測到的目標(biāo)多肽的含量(214nm是肽鏈的吸收波長)，紫外分光光度計檢測不到水和殘留的鹽不?？砂l(fā)現(xiàn)其他的雜質(zhì)包括：缺失序列（缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列），截斷序列（加帽過程中產(chǎn)生的序列）脫保護不完全序列（產(chǎn)生于整個合成過程或最后的裂解過程）。

多肽純化不涉及水和鹽。HPLC純化會產(chǎn)生少量的TFA，如：游離的氨基末端和其他側(cè)鏈如Arg、Lys、His都可生成少量TFA雜質(zhì)。通常交付的多肽多含有微量TFA和殘留水。即使處于凍干狀態(tài)，水也會因共價結(jié)合的能力不同而不同程度地存在著。

在多肽中還存在哪些其他物質(zhì)(雜質(zhì))?

純化前的多肽中包含的雜質(zhì)包括多肽和非多肽物質(zhì), 純化后的多肽中包含的雜質(zhì)除了TFA鹽，大多數(shù)為序列被修改的多肽。

1. 缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列
2. 為避免缺失序列的產(chǎn)生而進行的加帽操作，截斷序列即產(chǎn)生于加帽過程中
3. 產(chǎn)生于整個合成過程或最后的裂解過程
4. 保護基重新附著在多肽的其他位置

6. 什么是肽凈含量？

肽凈含量不同于多肽純度。肽凈含量是指與非肽物質(zhì)（主要為抗衡離子和水）相比的多肽量?？赏ㄟ^氨基酸分析來確定肽凈含量。如果您需要這項服務(wù)請在訂單上明確。通常，親水性多肽即使在嚴(yán)格的凍干狀態(tài)下，也會吸收微量的水。因純化和凍干工藝，會導(dǎo)致不同批次的肽凈含量有所不同。

7. 如何合成多肽？

不同于天然蛋白質(zhì)的合成，人工合成的方向是從C到N端。澤溪源的多肽合成是基于PeptideSyn技術(shù)平臺的Fmoc或t-Boc法的多肽合成。具體合成由下列幾個循環(huán)組成：①去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用piperidine去除氨基的保護基團。②激活和交聯(lián)：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。③循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。接著合成的肽從樹脂切割和去保護。最后被沉淀、洗脫、冷凍干燥。

7.What salt form should I use?

Peptides are usually delivered as TFA salts. If residual TFA would be problematic for your experiment, we recommend other salt forms such as acetate and hydrochloride. These salt forms are usually 20-30% more expensive than the regular TFA salt because of the peptide loss that takes place during the salt conversion and the greater amounts of raw materials required.

8. 如何合成多肽？

不同于天然蛋白質(zhì)的合成，人工合成的方向是從C到N端。澤溪源的多肽合成是基于PeptideSyn技術(shù)平臺的Fmoc或t-Boc法的多肽合成。具體合成由下列幾個循環(huán)組成：①去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用piperidine去除氨基的保護基團。②激活和交聯(lián)：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。③循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。接著合成的肽從樹脂切割和去保護。最后被沉淀、洗脫、冷凍干燥。

9. 澤溪源如何對合成的多肽進行質(zhì)檢？

公司對客戶提供的所有材料均嚴(yán)格保密。澤溪源總是在發(fā)送產(chǎn)品時，同時免費提供HPLC和MS檢測結(jié)果。公司所有多肽均采用反相色譜法純化。以質(zhì)譜法測定肽的分子量來確定產(chǎn)品是否正確，MS檢測結(jié)果還可顯示大部份的主要雜質(zhì)。如果必要，還可提供肽凈含量檢測，如氨基酸分析或元素分析。這些方法可以證實多肽的氨基酸組成，他們均可作為多肽確認(rèn)的補充方法。所有交付的肽均達到了客戶要求的純度。沒有達到純度要求的那些多肽均被丟棄。當(dāng)然如果客戶需要，也可以發(fā)送給他們。

10. 公司對合成的多肽提供分裝服務(wù)嗎？

根據(jù)要求，澤溪源可以將您的部分或全部訂單，免費分裝成小份。由于少量分裝可以避免多次反復(fù)凍融，減少容器的開蓋和閉合的次數(shù)，減少處理不當(dāng)或細菌污染的機會，讓您的多肽更加穩(wěn)定。

11. 什么是原料藥（APIs）、目錄肽（catalog peptides）、合成肽（custom peptide synthesis）？

原料藥（活性藥物成分）是醫(yī)藥中具有藥物活性的成分，如縮宮素、恩夫韋地等。目錄肽是市場上銷售的多肽，他們通常以較高的純度水平批量生產(chǎn)。合成肽通常是根據(jù)客戶的具體要求定制，如特定序列、修飾、不同純度、不同長度等要求。公司提供的API肽合成周期為2-3周。

12. 單個訂單的最少合成量是多少？

公司提供的單條訂單的最少合成量是1mg，用于研究的多肽和GMP藥物肽合成的量在澤溪源沒有上限。

13. 澤溪源能夠合成的多肽的最大長度是多少？

澤溪源成功合成了長度為120個氨基酸的多肽。 50個氨基酸長度的多肽屬于常規(guī)合成。

14. 什么是固相合成？

氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個氨基被封閉基團保護的氨基酸共價連接在固相載體上。在三氟乙酸的作用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就接到了固相載體上了。然后氨基被封閉的第二個氨基酸的羧基通過N,Nˊ-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被DCC活化的第二個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，形成二肽。重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端延長，直至達到所需要的肽鏈長度。

15. 什么是樹脂和鏈接劑?

樹脂是一種以聚苯乙烯等為基質(zhì)的聚合物支架，是人工合成的固相介質(zhì)。不同的樹脂有不同的特性。如聚乙二醇在非極性溶劑中膨脹，而聚苯乙烯在極性和非極性溶劑中都膨脹。鏈接劑是鏈接樹脂支架與基質(zhì)的中間結(jié)構(gòu)。不同的鏈接劑，適用于基質(zhì)中的不同功能團。

16. 什么是保護基團？

保護基團是能夠結(jié)合功能基團并阻斷其反應(yīng)活性的片段。有些是acid-labile保護基團，如Boc和tert-Bu酯類物質(zhì)。有些是base labile保護基團，如Fmoc和Fm酯類物質(zhì)。還有一些是fluoride-labile保護基團，如Tmsec和Tmse酯類物質(zhì)。為確保羧基和氨基間的有效耦合，保護基團應(yīng)該易于被附加和去保護，且不影響其它肽段。

17. 為什么要進行N端乙?；珻端酰胺化修飾？

化學(xué)合成的肽往往攜帶游離的氨基和游離的羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列，為了與母本蛋白更為接近，肽末端往往需要封閉，即N端乙?；虲端酰胺化，這些修飾會減少多肽的總電荷，降低多肽的溶解度，也可以使肽模擬它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始狀態(tài)。

如果需要對N端進行乙?；揎椈?qū)端進行酰胺化修飾，請在下單時明確。合成一旦結(jié)束，則不能再進行修改。

18. 熒光標(biāo)記時，肽和修飾標(biāo)記的染料之間需要加一個間隔嗎？

多數(shù)染料屬于大分子量芳香族氨基酸，在多肽中引入這一類大型分子，為了避免多肽與標(biāo)簽之間發(fā)生相互作用，維持蛋白的構(gòu)象及其生物學(xué)活性，我們推薦引入一個可彎曲的間隔區(qū)，比如Ahx, Ahx是一個含有6碳分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以維持熒光標(biāo)簽的穩(wěn)定性。否則，F(xiàn)ITC很容易結(jié)合多肽序列中的半胱氨酸殘基或者賴氨酸殘基。

通常情況下，生物素、FITC一類的染料既可以標(biāo)記在蛋白的氨基端也可以標(biāo)記在蛋白的羧基端。然而，為了在最短時間內(nèi)，最便捷又高效地合成多肽，澤溪源推薦客戶選擇標(biāo)記在氨基端。因為一個多肽的合成往往是從羧基端開始的，這樣一來，氨基端的修飾便成為最后一個環(huán)節(jié)，不需要再進行特別的結(jié)合作用。反之，羧基端修飾需要額外的環(huán)節(jié)，因此過程更加復(fù)雜。

19. 怎樣計算多肽的濃度？

Peptide Purity is the percentage target sequence amongst the total quantity of peptides. Because peptide bond formation in synthesis is not 100% efficient, not all polypeptide chains are the target sequence. Some chains may not go to completion, or amino acids may not properly bond on certain chains. These deleted sequences make up a certain percentage of peptides in your mixture. We analyze and purify crude peptides using Reverse Phase HPLC in conjunction with Mass Spec Analysis to attain the desired target sequence purity.

After your peptide is purified and lyophilized, the white peptide powder will contain some non-peptide components such as water, absorbed solvents, counter ions and salts. Net peptide content consists of the actual percentage weight of peptide in your final product. This number varies, anywhere from 50 to 90 percent, depending on the purity, sequence and method of synthesis and purification. When calculating the concentration of peptide solution for biological assays or other sensitive peptide experiments, it is essential that you account for peptide content. Peptide concentrations can be determined by subtracting away the non-peptide weight determining the volume of solvent in which to dissolve. For example, when using 1mg of final product to make a 1mg/ml solution of peptide with a content of 80%, you would use 800ul of solvent instead of 1000ul.

Peptide content is not an indication of peptide purity; these are two measurements. Purity is determined by HPLC and indicates the presence/absence of contaminating peptides with undesired sequences. Net peptide content only gives information on the percent of total peptide versus total non-peptide components independently of the presence of multiple peptides. Net peptide content is accurately found by performing amino acid analysis or UV spectrophotometry.

It is difficult to determine the actual peptide concentration based on the weight of the lyophilized peptide. Lyophilized peptides may contain 10-70% water and salts by weight. More hydrophilic peptides generally contain more bound water and salts compared to hydrophobic peptides.

If the peptide has a chromophore in the sequence (W or Y residues), peptide concentration can be conveniently determined based on the extinction coefficient of these residues.

The following steps can be used for the calculations:

1. Molar extinction coefficients of chromophoric residues at 280 nm at neutral pH using a 1-cm cell:
   • Tryptophan 5560 AU/mmole/ml
   • Tyrosine 1200 AU/mmole/ml
2. The extinction coefficient of each chromophore in the peptide sequence is generally considered to be additive, that is, the overall molar extinction coefficient of the peptide depends on the types and number of these choromophoric residues in the sequence.
3. Calculations: mg peptide per ml = (A280 x DF x MW) / e, where A280 is the actual absorbance of the solution at 280 nm in a 1-cm cell, DF is the dilution factor, MW is the molecular weight of the peptide and e is the molar extinction coefficient of each chromophore at 280 nm
4. Hypothetical example: A 50X diluted solution of a peptide with the sequence GRKKRRQRRRPPQQ (MW = 1847) reads 0.5 AU at 280 nm in a 1-cm cell. To calculate the original peptide concentration in the stock peptide solution:
   Mg peptide/ml = (0.5AU x 50 x 1847 mg/mmole) / [(1 x 5560) + (2 x 1200)] AU/mmole/ml = 5.8
5. Cautions:

• Any absorbance calculation assumes that the peptide is unfolded and the chromophores are exposed, which is usually the case in short, soluble peptides. If there are doubts about the solubility or the folding of the peptide, it is advisable to make the measurement under denaturing conditions (e.g., 6M GdnHCl or 8M urea). Obviously, these peptide solutions will be rendered useless, unless the denaturants are removed.
• If the sequence does not have Trp or Tyr, the only practical option is to do amino acid analysis.

20. 如何利用SDS-PAGE法去除小的多肽？

您的樣品中是否含有<20 kDa的目標(biāo)蛋白？ 請點擊下載關(guān)于 用SDS-PAGE法去除小分子合成肽的方案。Tricine-SDS-PAGE方案其中包括考瑪斯亮藍染色和電泳的實驗方法。

Tricine-SDS-PAGE被普遍用于分離分子量為1-100 kDa的蛋白，它被認(rèn)為是分辨<30 kDa蛋白的首選電泳系統(tǒng)。

21. 如何將多肽溶解在DMSO中？

二甲基亞砜（DMSO）是一種含硫有機化合物，分子式為（CH3)2SO，常溫下為無色無臭的透明液體。DMSO作為冷凍保護劑經(jīng)常應(yīng)用于細胞庫。在細胞冷凍過程中，DMSO可防止胞內(nèi)/胞外晶體的形成，其工作濃度為10%。DMSO通常可與鹽或血清白蛋白結(jié)合。

疏水性多肽可以很容易地溶解在DMSO中。但DMSO可增加細胞的通透性，若多肽溶解于DMSO中則會對細胞產(chǎn)生毒性作用。高濃度的DMSO絕不可應(yīng)用于細胞培養(yǎng)中。濃度為5%的DMSO即可讓細胞膜溶解。大多數(shù)細胞株可以容忍0.5% DMSO，少許可以容忍1%的濃度，而不表現(xiàn)出嚴(yán)重的細胞毒性。然而原代細胞培養(yǎng)對其更敏感。所以如果是用原代細胞做劑量/反應(yīng)曲線(可行性)，其濃度應(yīng)低于0.1%。

對于某些疏水性非常高的多肽，可先嘗試將其溶解在少量的DMSO(30-50ul,100%)中，然后慢慢 (一滴一滴地)將其添加到不斷攪拌的水溶液如PBS或其他想要的緩沖液中，直至理想濃度。如果滴加過程中，肽溶液開始變渾濁，說明已經(jīng)達到了溶解極限。另外，超聲波有助于多肽溶解。

經(jīng)驗:

• 對幾乎所有的細胞來說，濃度為0.1%DMSO是安全的。
• 廣泛被用于細胞培養(yǎng)的DMSO終濃度為0.5%，不會引起細胞毒性。
• 雖然對部份細胞來說，1%DMSO也不會產(chǎn)生細胞毒性，但我們推薦0.5%。
• 也有5%DMSO成功地應(yīng)用于某些細胞的案例。
• 始終保持終濃度在0.5%，但儲存時可200倍高濃度溶于100%的DMSO中。