磷酸化作用-多肽修飾

磷酸化影響著細胞生命的方方面面。蛋白激酶通過調(diào)節(jié)信號通路和細胞進程，影響胞內(nèi)通信功能的每一方面。然而異常的磷酸化也是引起諸多疾病的起因。尤其是突變的蛋白激酶、磷酸酶可導(dǎo)致許多紊亂。很多天然毒素和病原體也是通過改變胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)來發(fā)揮它們的影響。

絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）的磷酸化作用是一個可逆的蛋白修飾過程，它們參與調(diào)節(jié)無數(shù)的細胞活動，如受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)締合與分割、激活或抑制蛋白功能，甚至細胞的存活等。磷酸鹽是帶負電的(每一個磷酸基攜帶兩個負電荷)。因此，他們的加入會改變蛋白屬性，這種變化通常是構(gòu)象變化，引起蛋白質(zhì)改變它的構(gòu)造方式。當(dāng)磷酸基團被去除時，蛋白質(zhì)構(gòu)象又會恢復(fù)至原始狀態(tài)。如果這兩種構(gòu)象的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出不同的活性，那,磷酸化可以作為此蛋白控制其活性的分子開關(guān)。

許多激素均是通過提高絲氨酸（Ser）或蘇氨酸（Thr）殘基的磷酸化狀態(tài)來調(diào)節(jié)特異性酶的活性。生長因子（如胰島素）可以觸發(fā)酪氨酸（Tyr）的磷酸化作用。這些氨基酸的磷酸基團是可以迅速地被去掉的，因此，Ser、Thr和Tyr的功能在調(diào)控細胞活動的過程（如腫瘤擴散）中起到分子開關(guān)的作用。

合成肽在研究蛋白激酶底物以及相互作用的領(lǐng)域起著非常有用的作用。但目前一些因素阻礙或限制了磷酸化多肽合成技術(shù)的適應(yīng)性，如無法實現(xiàn)固相合成全自動化、缺乏與標(biāo)準分析平臺之間的便利連接等。澤溪源基于PeptideSyn^TM 平臺的多肽合成及磷酸化修飾技術(shù)克服了這些限制，同時提高了的合成效率也顯示了它的可擴展性。PeptideSyn^TM 平臺非常適合于蛋白激酶底物、抗原、結(jié)合分子和抑制劑的研究。

• 我們提供pSer、pTyr、pThr和D-pSer、D-pTyr、D-pThr的磷酸化修飾服務(wù)。
• 可同時進行2個位點、3個位點、4個位點、5個位點的磷酸化修飾，如：NDEpSpTDYEpSERQpTD。

成功案例：固相合成帶有4個磷酸化位點的多肽

14aa的多肽（MW：1981.53），4個磷酸化位點（xxxpSpTxxxpSxxxpTx），純度為95%，完成周期為3周。

HPLC Results:

MS Results:

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檢測蛋白質(zhì)磷酸化的方法集錦

Radiolabel學(xué)者的研究表明在真核細胞中大約30%的蛋白會經(jīng)受磷酸化作用。一個經(jīng)典的檢測蛋白磷酸化的方法是，二維凝膠電泳或細胞經(jīng)放射性標(biāo)記32p-正磷酸鹽孵育，提取細胞裂解液，經(jīng)SDS-PAGE作蛋白分離，,然后暴光于膠片。這些方法不僅需要大量人力，而且需用到放射性同位素。以下簡述了幾種目前用于檢測磷酸化的方法。

• 激酶活性檢測

在體外，激酶活性的檢測是將經(jīng)免疫沉淀法獲得的蛋白激酶與某一底物在ATP環(huán)境下共同孵育，然后再檢測。磷酸化底物的測量可以通過報告系統(tǒng)如比色法、放射性或熒光檢測而得。

• 磷酸化特定性抗體的開發(fā)

磷酸化抗體已被許多研究者使用。澤溪源為研究人員開發(fā)了許多磷酸化特異性抗體。首先合成磷酸化多肽，即圍繞靶蛋白磷酸化位點的氨基酸序列，接著共軛偶聯(lián)至血藍蛋白(KLH)上進行免疫。免疫血清將流經(jīng)多肽親和層析柱，從而得到一個非常特異的免疫制劑。檢測的成功與否取決于抗體對靶磷酸化蛋白的特異性和親和力。

• 免疫印跡（Western Blot）

許多磷酸化抗體是十分敏感的，可以很容易地檢測到常規(guī)樣品中的磷酸化蛋白。化學(xué)發(fā)光和比色法都是較常見的檢測方法，蛋白Markers通常用來為蛋白質(zhì)量提供標(biāo)準。

• 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

ELISAs提供一種間接測量激酶活性的方法，其比WB更容易定量。磷酸化特異的ELISA技術(shù)可以很輕易地通過使用一個校準標(biāo)準來量化結(jié)果。通過雙抗體夾心方法，應(yīng)用兩個靶蛋白的特異性抗體可使檢測呈現(xiàn)高特異性。此外,基于微孔板的ELISAs檢測，更是具有高通量、微量和對低豐度蛋白檢測的特點。

• 細胞ELISA（Cell-Based ELISA）

通過分析完整的細胞中磷酸化蛋白，可更準確地反應(yīng)特性的信號網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。一般磷酸化抗體多通過熒光或比色法來檢測磷酸化狀態(tài)。

• 流式細胞術(shù)(FCM)和ICC / IHC

流式細胞術(shù)因其快速、定量、單細胞分析等特點而非常具有優(yōu)勢。細胞被誘導(dǎo)后，通過甲醛或多聚甲醛將其與磷酸化蛋白交聯(lián)固定，然后分析。固定的細胞需經(jīng)通透處理，以便磷酸化抗體的進入。

• 質(zhì)譜分析（Mass Spectrometry）

質(zhì)譜(MS)技術(shù)是一項用于識別磷酸化蛋白、磷酸化多肽和磷酸化殘基序列的便利工具。利用MS卓越的靈敏度和分辨率，可識別某一單個蛋白質(zhì)或多肽。但來自磷酸化多肽的信號通常較弱，因而新的技術(shù)正在被研發(fā)以增強MS信號。這些策略包括固化金屬親和層析，磷酸化抗體的豐富，化學(xué)修飾方法和用生物素部份置換磷酸基團。

• xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技術(shù)

Multi-Analyte profiling技術(shù)涉及磷酸化抗體的應(yīng)用和基于微孔板及膜的檢測方式。這些檢測技術(shù)可提供大量的數(shù)據(jù)，卻只需極少量的樣本。然而，這些檢測技術(shù)并不比傳統(tǒng)的檢測方法敏感，原因在于潛在的抗體交叉反應(yīng)。