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FAM-labelled MsSSB-Ct peptides were synthesized by LifeTein LLC.
TAMRA labeled CD81 peptides were synthesized by LifeTein LLC.
Biotinylated RON2 peptide were synthesized by LifeTein LLC.
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多肽熒光標記: FITC, FAM, TAMRA, Biotin, EDANS/Dabcyl...
熒光染料是生物分子標記的重要工具。熒光素衍生物可被廣泛地標記在那些用于熒光顯微鏡、流式細胞儀和免疫熒光檢測等領(lǐng)域的試劑上。
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熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)
熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過程。此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的。該分析方法具有快速、敏感和簡單等優(yōu)點。
用于FRET試驗的染料是可以相同的。但在大多數(shù)應(yīng)用中其實是使用不同的染料。簡單地說，熒光共振能量轉(zhuǎn)移是在供體基團的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導的能量從供體(染料1)向受體(染料2)轉(zhuǎn)移的過程。通常，供體 （Donor）熒光基團的發(fā)射光譜要與受體（Acceptor）基團的吸收光譜有一定的重疊。當這兩個熒光基團間的距離合適時（10 – 100 ?)），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。能量轉(zhuǎn)移發(fā)生方式依賴于受體的化學結(jié)構(gòu)：
- a) 被轉(zhuǎn)化為分子的振動，即發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅。(受體是猝光劑)
- b) 發(fā)射更強于受體本身的特征熒光，造成次級熒光光譜的紅移。 (受體是熒光發(fā)射體)。
一個供體基團（EDANS）和接受基因（DABCYL）勻被連接到一HIV蛋白酶的天然底物上，當該底物未被切斷時，DABCYL可淬滅EDANS，從而檢測不到熒光。當該底物被HIV-1蛋白酶切斷后，EDANS不再被DABCYL淬滅，隨即可檢測到EDANS熒光。蛋白酶抑制劑的有效性可憑借EDANS熒光強度的變化進行監(jiān)測。
FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應(yīng)過程可被連續(xù)監(jiān)測，為酶活性的檢測提供了一個便捷的方法。供體/受體對的肽鍵水解后產(chǎn)生的熒光可衡量納摩爾級濃度的酶活性。當FRET肽是完整的，表現(xiàn)出的是內(nèi)部的熒光猝滅，但當供體/受體對的任何肽鍵斷裂就會釋放出熒光，此熒光可被連續(xù)檢測，從而可對酶的活性進行定量分析。
FRET 肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：
- 肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動力特征和功能特征。
- 對新的蛋白水解酶的篩選和檢測。
- 對多肽折疊的構(gòu)象研究。
以下是一些用于FRET的標準染料組合::
- Fluorescein and Dabcyl:FAM/Lys(Dabcyl)
- Fluorescein and Tamra: FAM/TAMRA
- Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA) and 2,4-Dinitrophenyl(DNP): MCA/Lys(Dnp).
- Ortho-aminobenzoic acid (Abz) and 2,4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp): Abz/Tyr (NO2), Abz/EDDnp
- Dabcyl and Glu(EDANS)
在蛋白酶的多肽底物內(nèi)經(jīng)共振能量轉(zhuǎn)移引發(fā)熒光猝滅的供體-接受對
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波長(nm) |
猝滅劑 |
熒光團 |
激發(fā)波 |
發(fā)射波 |
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Dabcyl
Dansyl
DNP
DNP
DNP
Tyr (NO2) |
Edans
Trp
Trp
MCA
Abz
Abz |
336
336
328
328
328
320 |
490
350
350
393
420
420 |
常規(guī)RET供體-接受對的福斯特臨界距離（Forster Critical Distance）
Donor |
Aceptor |
Forster Distance
(Nanometers) |
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Tryptophan
IAEDANS (1)
BFP
Dansyl
Dansyl
CFP
CF (3)
Fluorescein
Cy3
GFP
BODIPY FL (4)
Rhodamine 6G
FITC
B-Phycoerythrin
Cy5 |
Dansyl
DDPM (2)
DsRFP
FITC
Octadecylrhodamine
GFP
Texas Red
Tetramethylrhodamine
Cy5
YFP
BODIPY FL (4)
Malachite Green
Eosin Thiosemicarbazide
Cy5
Cy5.5 |
2.1
2.5-2.9
3.1-3.3
3.3-4.1
4.3
4.7-4.9
5.1
4.9-5.5
>5.0
5.5-5.7
5.7
6.1
6.1-6.4
7.2
>8.0 |
(1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
(2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
(3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
(4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene
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異硫氰酸熒光素（FITC）與羧基熒光素相比更具活性，而且后者需要被激活才能使用。FITC主要是與巰基反應(yīng)，如還原型半胱氨酸的側(cè)鏈，尤其是多肽或蛋白中的氨基。
對眾多應(yīng)用來說，在化學合成過程中引入熒光標記是很容易的。 如在固相合成過程中，F(xiàn)ITC可以與賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護的鳥氨酸（ornithine）側(cè)鏈，或合成過程中的多肽N端氨基反應(yīng)。當在N端標記時，建議在最后一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。
鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免。
空間位阻被認為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標記的多肽上。
通常，生物素、FITC等染料可任意標記在多肽N端或C端。但我們推薦N端標記，其成功率更高、所需時間更短、更易操作。由于多肽都是從C端往N端合成，所以N端修飾將是固相合成的最后一步，不再需要額外的偶聯(lián)步驟。相反，如果是C端標記，則需要附加步驟，而過程會更復雜。
大多數(shù)染料都是大型的芳香分子，如此龐大分子的介入有助于避免標簽和多肽之間的相互作用。這將有助于保持多肽的構(gòu)象和生物學活性。一般來說，推薦引入一個柔性間隔如Ahx(一個6碳化合物)會使熒光標記更加穩(wěn)定。否則FITC將很容易與其他任何位置的半胱氨酸的巰基或賴氨酸的氨基發(fā)生連接。
| Probe |
Ex (nm) |
Em (nm) |
MW |
Notes |
| Methoxycoumarin (MCA) |
360 |
410 |
317 |
Succinimidyl ester |
| Fluorescein (FITC) |
495 |
519 |
389 |
FITC; pH sensitive |
| X-Rhodamine |
570 |
576 |
548 |
XRITC |
| Lissamine Rhodamine B |
570 |
590 |
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澤溪源熒光列表，包括吸收峰和發(fā)射峰 |
多肽合成常見問題解答（FAQs）
點擊查看更多澤溪源多肽合成的FAQs
熒光標記時，肽和修飾標記的染料之間是否需要添加一個間隔？
如何溶解多肽?
我該如何選擇適合自己研究的最佳純度？
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成功案例1
這個事例闡述了用于FRET檢測的基本方法。熒光分子methoxycoumarine acetic acid（MCA)被標記在多肽的N端，該多肽被設(shè)計作為及基質(zhì)金屬蛋白酶溶基質(zhì)素的底物，在易斷裂的Gly-Leu肽鍵（可被酶水解）之后，連接猝滅劑N-3-(2, 4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl（DPA）(Knight el al., 1992)。
完整多肽序列如下:
MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2
MCA的最大吸收峰是328nm，最大發(fā)射峰是393nm。 DPA基團在363nm處有很強的吸收譜，并在410nm處有明顯的肩峰。該肩峰與MCA熒光譜重疊，從而導致了顯著的熒光猝滅。
研究發(fā)現(xiàn)，1μm MCA-Pro-Leu（酶解產(chǎn)物）溶液的熒光量是等量MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2溶液的130倍，其激發(fā)波和發(fā)射波分別為328nm、 393nm。
多肽酶解導致了MCA與DPA基團的分裂，因而MCA熒光大大地增強。熒光增強可隨著時間變化地跟蹤，并可以此度量反應(yīng)速度，研究者借此可以確立該肽作為幾個及基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員的底物的Kcat/Km值。此檢測方法最近被用來測定溶基質(zhì)素的潛在抑制能力，即通過酶反應(yīng)的初速度來衡量抑制效果 (Copeland et al., 1995)。
成功案例2
客戶定制了一個疏水性很高的68aa多肽（純度>85%），同時熒光素FITC被標記在該多肽的N端。此多肽合成僅花了4周時間。
HPLC 分析:
MS 分析:
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多肽熒光標記、熒光修飾報價：
- 方法一： 通過在線的報價系統(tǒng)
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