多肽和蛋白的相互作用

檢測與某一多肽相互作用的物質(zhì)，最簡單的方法就是利用此多肽做親和pull-down實驗，然后直接檢測結(jié)合蛋白。蛋白質(zhì)體外結(jié)合(Pull-down)試驗可用于驗證蛋白-蛋白相互作用的存在（經(jīng)由別的研究方法預(yù)測過的，如免疫共沉淀）和作為一種初級的篩選試驗來識別一些未知的蛋白-蛋白相互作用。通過競爭性阻斷結(jié)合，合成肽通常被用來驗證被假設(shè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

生物素標記肽含有一個特殊的功能區(qū)和相當(dāng)于參照的未修飾肽，此肽可被錨定在親和素共軛的磁珠上，將這些磁珠與目標樣本共同孵育（如核提取物或純化的重組蛋白），通過洗滌去除未結(jié)合的蛋白，然后洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)， SDS/ PAGE分析，經(jīng)蛋白染色即可直接觀察。通過比較分別與修飾和未修飾多肽相結(jié)合的蛋白質(zhì)，即有可能確定候選者，即特定功能蛋白的“reader”蛋白。

帶有一些特殊修飾的生物素標記肽可以通過化學(xué)合成，純度達80％以上。肽長度應(yīng)該在15-20個氨基酸。目標修飾位于序列中間時，兩翼氨基酸殘基不能少于6-8個。一般情況下，生物素多被偶聯(lián)在N末端或C末端。如果無特殊要求，我們建議生物素偶聯(lián)至N-末端，其優(yōu)勢是修飾的成功率更高，生產(chǎn)的時間更短，并且易于操作。此外，如果偶聯(lián)至C-末端，需要額外增加一個賴氨酸。

生物素標記肽的Pull-down實驗方案

生物素標記肽可與親和素磁珠共軛以生成樹脂，用于肽pulldown試驗。先把生物素標記肽上樣至Immobilized streptavidin beads (Pierce) 錨定有親和素的磁珠上，再與細胞裂解液孵育。細胞裂解于1％（v/v）Nonidet P-40, 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, protease inhibitors (Complete Tablets, Roche Applied Science), 加入 1 mM sodium orthovanadate作為磷酸酶抑制劑。等量的蛋白質(zhì)分別與被錨定的多肽在4℃孵育6小時。經(jīng)過大量洗滌，在SDS樣品buffer中煮沸，結(jié)合蛋白可從被錨定的多肽洗脫下來，或者，用50 mM dithiothreitol將多肽與蛋白復(fù)合物從磁珠中斷開。將來自活性肽和對照目標肽pull-downs的洗脫液合并，以作進一步的分析。

上圖為鏈霉親和素-生物素鍵力測量示意圖。由于它們異常高的親和結(jié)合性，其中最突出的配體-受體對是鏈霉親和素-生物素（streptavidin-biotin）和親和素-生物素（avidin-biotin）。 這兩種蛋白質(zhì)都有一個四聚體的結(jié)構(gòu)，這樣他們可以結(jié)合4個配體。

肽結(jié)合特性

hsp70（相對分子質(zhì)量為70K的熱休克蛋白）僅可識別未折疊蛋白。為了研究蛋白相互作用中每個氨基酸的偏好，Gregory C. Flynn等學(xué)者用人工合成的隨機序列多肽去替代免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)（BiP）的結(jié)合位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BiP的結(jié)合位點表現(xiàn)出相當(dāng)大的特異性。

• 多肽長度：7個氨基酸的多肽與hsp70家族結(jié)合的最好。通常6-10個氨基酸的多肽即可很好地結(jié)合。增加多肽的長度并不能增加其結(jié)合的特異性。


• 氨基酸偏好：能夠與BiP復(fù)合物結(jié)合的多肽鏈普遍顯示含有豐富的脂肪族氨基酸，如甘氨酸（Glycine）、（Alanine）、纈氨酸（Valine）、亮氨酸（Leucine）、異亮氨酸（Isoleucine）和脯氨酸（Proline）。


• 在BIP復(fù)合物中含量最豐富的是亮氨酸（Leucine），說明亮氨酸在蛋白結(jié)合中的重要作用。
• 無支鏈的氨基酸（如蛋氨酸（Methionine））和支鏈遠離主干的氨基酸（如亮氨酸（Leucine））往往傾向于與BiP結(jié)合。這可能是因為側(cè)鏈的靈活性和疏水性有利于結(jié)合。
• 即使具有最強的疏水性，但由于芳香族類氨基酸（苯丙氨酸（Phenylalanine）、酪氨酸（Tyrosine）、色氨酸(Tryptophan)）不具有靈活的側(cè)鏈，因而對結(jié)合來說并不太重要。
• 任意含1.6個脂肪族氨基酸殘基的7肽勻可高效與BiP結(jié)合。

參考文獻: Gregory C. Flynn, Jan Pohl, Mark T. Flocco & James E. Rothman. Peptide-binding specificity of the molecular chaperone BiP. 24 October 1991, Nature 353, 726-730 doi:10.1038/353726a0.